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      PNAS | 酒亞明課題組揭示宿主細胞中間絲在寨卡病毒感染中的雙重作用

        

        2月22日,中國科學院上海巴斯德研究所酒亞明課題組在國際期刊PNAS發表了題為Host cytoskeletal vimentin serves as a structural organizer and an RNA-binding protein regulator to facilitate Zika viral replication”的文章,該研究利用多種顯微成像技術和組學分析,首次闡述了中間絲波形蛋白vimentin在寨卡病毒感染中的物理空間支撐與生物功能調控的雙重作用。 

       

       

        寨卡病毒(Zika virus, ZIKV)是帶包膜的單鏈正義RNA的黃病毒屬病毒,因其感染會導致新生兒小頭畸形、格林-巴利綜合征等神經性疾病而被廣泛關注(1-4)。ZIKV進入胞內后會在內質網膜進行復制,產生大量雙鏈RNA、病毒基因組RNA和病毒蛋白,這些病毒組分和被劫持的宿主因子一起在核周聚集形成病毒復制工廠以提供高效的病毒復制(5-7),但是在此過程中發生劇烈重構的宿主細胞骨架發揮怎樣的生物功能尚不清楚。

        細胞骨架包括微絲、微管和中間絲,三者互相交織形成網絡為細胞內提供機械支撐,參與細胞器定位、物質運輸、信號傳導等重要生物過程(8,9)。波形蛋白(vimentin filaments)屬于細胞骨架中間絲,主要圍繞細胞核向細胞邊緣輻射狀分布。近年來一些研究發現vimentin filaments在病毒感染中會發生重構向核周聚集,但是其在ZIKV感染過程中的動態變化及其生物功能尚不清楚。除此之外,細胞骨架蛋白還能參與調節胞內轉錄翻譯機器(10)。但是中間絲vimentin與胞內轉錄翻譯機器之間的物理空間和生物功能上的關系尚不清楚,尤其在病毒感染情況下,vimentin filaments與病毒復制工廠形成的聯系完全未知。

        研究人員首先利用共聚焦顯微鏡、活細胞實時觀察、超高分辨率顯微鏡和電鏡等生物成像技術觀察到隨著ZIKV感染時間的延長,細胞內vimentin filaments逐漸向核周聚集,形成籠狀結構以包裹病毒復制工廠組分如dsRNA、NS4B和Env (圖1),內源表達病毒蛋白Env也能誘導vimentin filaments產生類似的現象。

       

        圖1. Vimentin filaments圍繞ZIKV病毒蛋白形成籠狀結構  

       

        之前就有一些文章報道了vimentin filaments在多種病毒感染中均會出現類似重構現象(11-17),為了進一步研究這一變化的具體意義和機制,研究人員利用CRISPR/Cas9技術敲除人骨肉瘤細胞系U2OS和人肝癌細胞系Huh7中的vimentin后,發現病毒復制工廠組分NS4B、Env或dsRNA的胞內定位由核周聚集變為呈多塊分散 ,并使病毒RNA復制、蛋白合成、子代病毒產生量和整體感染率都顯著降低。有趣的是,只有在敲除細胞中回補全長vimentin才能使病毒復制工廠在被vimentin filaments的包裹下重新向核周聚集成團,回補只能形成八聚體(unit length of filaments,ULF)不能成絲的vimentin不能挽救其分散表型。除此之外,研究人員發現ZIKV感染后細胞內另一中間絲巢蛋白(nestin filaments)和波形蛋白一起發生了向病毒復制工廠聚集的變構,但是單敲除nestin基因并不影響ZIKV的復制,而單敲除vimentin不僅影響nestin的表達還影響病毒復制工廠的定位。這些結果表明vimentin保證了ZIKV復制工廠的高密度核周聚集,是病毒高效感染的必要條件,并且其功能在細胞多種中間絲中具備獨特性和重要性。

        為了進一步研究vimentin具體影響了ZIKV病毒感染的哪些步驟,研究人員在野生型和vimentin敲除細胞系中做了不同感染時間點實驗,和病毒結合/進入細胞實驗,結果發現敲除vimentin并不影響ZIKV結合或進入細胞,但會使病毒蛋白積累量持續低于野生型細胞。為了辨別這種病毒蛋白的降低是合成減少還是降解增加,研究人員分別在兩種細胞內過表達病毒Env-EGFP和NS4B-EGFP蛋白,并分別用蛋白合成抑制劑cyclohemide (CHX)、蛋白酶體抑制劑MG132、溶酶體抑制劑NH4Cl處理,結果發現vimentin影響了病毒蛋白合成而非降解。

        因為vimentin filaments正常情況下和ZIKV感染情況下的細胞內定位與內質網高度重合,且敲除vimentin使內質網分布更加擴散,提示vimenitn和內質網之間存在重要聯系。研究人員利用質譜結果進行蛋白質組學分析發現胞內vimentin和大量位于內質網的RNA結合蛋白(RNA-binding proteins, RBPs)存在互作。進一步RNA測序組學分析發現,相對于野生型細胞,vimentin敲除細胞感染病毒后大量內質網相關的具備雙鏈RNA結合功能和轉錄調節功能的基因表達發生顯著下調,這些結果進一步印證了vimentin參與寨卡病毒RNA復制過程。綜合兩種組學分析結果,研究人員將目光聚焦于內質網上一跨膜蛋白核糖體結合蛋白1(ribosome-binding protein 1, RRBP1),并利用蛋白質體外結合實驗(pull-down assay)驗證了vimentin和RRBP1相互作用。在2019年就有文章報道RRBP1能直接結合病毒RNA從而幫助黃病毒復制,缺失RRBP1基因使胞內寨卡病毒RNA水平下降約40%(18)。 為了探究vimentin和RRBP1分子在ZIKV感染中的關系,作者在野生型細胞和vimentin敲除細胞中分別敲低RRBP1基因表達,觀察兩者胞內表達和定位情況,并對比ZIKV在其中的感染情況。結果發現缺失vimentin使RRBP1在mRNA和蛋白質水平均下降約50%,且RRBP1和內質網信號在胞內定位更加分散,出現了類似病毒復制工廠分散的現象,雖然RRBP1與內質網共定位關系不變,但RRBP1與ZIKV dsRNA共定位水平顯著下降。這說明vimentin對于ZIKV感染后內質網的精細變構發揮重要作用,使病毒復制工廠保持致密結構,并聚集其余宿主分子如參與病毒轉錄翻譯的ER相關蛋白使其保持高效復制。反之RRBP1敲低卻不影響vimentin的轉錄翻譯水平和胞內定位。單獨敲除vimentin使病毒復制下降的水平遠大于單獨敲除RRBP1,且和雙敲除的抑制效率類似,這表明vimentin可能作為RRBP1上游分子調控其參與病毒RNA復制過程。

        縱觀整篇文章,這項研究揭示了在受到寨卡病毒感染后,細胞中間絲波形蛋白網絡會逐漸向核周聚集形成籠狀結構包裹病毒復制工廠,匯聚重要的宿主因子和病毒組分,與眾多內質網蛋白互作如RRBP1以促進病毒RNA復制,從而同時在物理空間和生物功能上幫助病毒在胞內形成完整致密的病毒復制工廠以促進病毒產生,這提示vimentin可作為ZIKV感染治療的潛在宿主靶點。

       

        圖2. Vimentin filaments在ZIKV病毒感染過程中作為‘結構支撐’和‘調節因子’的雙重功能 

       

        中國科學院上海巴斯德研究所博士生張悅為該文章第一作者;中國科學院上海巴斯德研究所酒亞明研究員、復旦大學上海市公共衛生臨床中心金俠教授為該文章的共同通訊作者;中國科學院生物物理研究所薛艷紅研究員和中國科學院上海巴斯德研究所崔杰研究員為該文章的樣品制備和數據收集提供了支持;該研究也得到了芬蘭 Abo Akademi University的John E. Eriksson教授、中國科學院分子細胞科學卓越創新中心的鮑嵐研究員與朱學良研究員的支持和幫助。

        【實驗室簡介】

        中科院上海巴斯德研究所酒亞明課題組一直圍繞細胞骨架調控腫瘤轉移和病原體感染這兩大類疾病研究,優化并融合了一系列先進光學成像技術和病毒細菌感染實驗體系,從細胞骨架、信號轉導和病原體宿主互作等多個角度,深入解析了細胞骨架與疾病的分子機理,旨在為癌癥以及相關感染性疾病的精準治療提供新理論、藥物靶點和治療策略。酒亞明研究員圍繞上述工作取得一系列重要原創性成果,發表高水平SCI學術論文40余篇,近期研究成果以通訊作者在PNAS, JCB, Current Biology等高水平雜志發表。作為一支朝氣蓬勃、熱愛科學、團結協作的科研團隊,課題組熱忱歡迎優秀的博士后、博士及研究生聯系加入,聯系方式ymjiu@ips.ac.cn。

        原文鏈接:https://www.pnas.org/content/119/8/e2113909119

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